Espanjalaisen valloittajan Don Nuño Beltrán de Guzmánin jatkuvat hyökkäykset maan länsimaita kohti, jotta hänen hallintoaan ja valtaansa näillä alueilla lisääntyisi, johti uuden maakunnan perustamiseen, nimeltään Uuden Galician kuningaskunta.
Alueella asui useita alkuperäiskansojen ryhmiä, jotka tuhosivat jatkuvasti asutuksia, jotka espanjalaiset olivat perustaneet siihen. Nuño de Guzmánin luutnantti, kapteeni Juan B. de Oñate, sai käskyn rauhoittaa nämä maakunnat ja perustaa Villa de Guadalajara Nochistlán -nimiseen paikkaan, mikä toteutui 5. tammikuuta 1532. Ottaen huomioon kaupunkiin kohdistuvat usein alkuperäiskansojen hyökkäykset hänen täytyi muuttaa vuotta myöhemmin Tonaláan ja myöhemmin Tlacotlániin. Kolmas siirto tehtiin kaupungin asettamiseksi Atemajacin laaksoon, jossa kaupunki lopullisesti perustettiin 14. helmikuuta 1542, kun Cristóbal de Oñate oli läsnä Nueva Galician kuvernöörinä ja Don Antonio de Mendoza, Sitten Uuden Espanjan varakuningas, joka nimitti Miguel de Ibarran pormestariksi ja luutnanttikuvernööriksi.
Kaupunki kehittyi nopeasti ja alkoi kilpailla Compostelan (nykyään Tepic) kanssa, joka oli silloin uskonnollisten ja siviilivaltojen kotipaikka, niin että Guadalajaran asukkaat painostivat Audiencian viranomaisia niin paljon, että kuningas Felipe II päätti myöntää 10. toukokuuta 1560 päivätyn todistuksen, jotta hän muuttaisi Compostelasta Guadalajaraan, katedraaliin, kuninkaalliseen hoviin ja valtiovarainministeriöön.
Kaupunkirakenne suunniteltiin muiden siirtomaa-kaupunkien suunnitelmien mukaan, joten sen ulkoasu kehitettiin shakkilaudan muodossa San Fernandon aukiolta. Myöhemmin Fray Antonio de Segovia perusti Mexicaltzingon ja Analcon naapurustot ja yhden vanhimmista Mezquitánin naapurustot. Kaupungintalon talot rakennettiin myös vastapäätä nykyistä San Agustínin temppeliä ja ensimmäistä seurakunnan kirkkoa, jossa sijaitsee oikeuden palatsi.
Nykyään upeassa kaupungissa, joka on tuottanut siirtomaa-ajan rakennuksia, on runsaasti merkityksellisiä arkkitehtonisia esimerkkejä, kuten sen katedraali, joka on must-see-paikka, jonka arkkitehti Martín Casillas rakensi vuosina 1561-1618. Hänen tyylinsä on luokiteltu alkavaksi barokiksi. Sen vankka rakenne kohoaa nykyisen Plaza de Guadalajaran edessä, sen uteliaisilla torneilla, jotka tunnetaan nykyään Guadalajaran pääkaupungin symbolina, vaikka ne eivät kuulu rakennuksen alkuperäiseen tyyliin. Alkeelliset tornit tuhoutuivat 1800-luvulla maanjäristyksen vuoksi, minkä vuoksi nykyiset tornit lisättiin. Temppelin sisustus on puoligoottista tyyliä, mukaan lukien sen pitsiholvit.
Muita 1500-luvulta peräisin olevia uskonnollisia alueita ovat San Franciscon luostari, joka perustettiin vuonna 1542 joen lähelle, Analcon naapurustoon, ja melkein kokonaan tuhoutunut uskonpuhdistuksen aikana. Sen temppeli, joka on kunnostettu 1700-luvun lopulla, ja sen barokkijulkisivu, jossa on vaatimattomia salomonijonoja, säilyy. San Agustínin luostari perustettiin vuonna 1573 Felipe II: n kuninkaallisella asetuksella, ja se säilyttää nykyään temppelinsä kovien Herrerian-viivojen julkisivulla ja sisätiloissa, joissa on uurretut holvit.
Santa María de Gracia, toinen luostarirahastoista, oli Pueblan Dominikaanisen nunnan omistuksessa, rakennettu vuonna 1590 Plaza de San Agustínin eteen ja maksanut Hernán Gómez de la Peña. Rakentaminen oli miehitetty kuudesta korttelista, vaikka nykyään vain sen temppeli jatkuu, ja uusklassinen julkisivu 1700-luvun jälkipuoliskolta.
